Молекулярно цитогенетическое исследование fish


Современный метод цитогенетического анализа, позволяющий определять качественные и количественные изменения хромосом (в том числе транслокации и микроделеции) и используемый для дифференциальной диагностики злокачественных заболеваний крови и солидных опухолей.

Синонимы русские

Флуоресцентная гибридизация in situ

FISH-тест

FISH-анализ

Синонимы английские 

Fluorescence in-situ hybridization

FISH test

Метод исследования

Флуоресцентная гибридизация in situ.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Образец ткани, образец ткани в парафиновом блоке.

Как правильно подготовиться к исследованию?

Подготовки не требуется.

Общая информация об исследовании

Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH, от англ.


uorescence insitu hybridization) – это один из самых современных методов диагностики хромосомных аномалий. Он основан на использовании ДНК-проб, меченных флуоресцентной меткой. ДНК-пробы представляют собой специально синтезированные фрагменты ДНК, последовательность которых комплементарна последовательности ДНК исследуемых аберрантных хромосом. Таким образом, ДНК-пробы различаются по составу: для определения разных хромосомных аномалий используются разные, специфические ДНК-пробы. ДНК-пробы также различаются по размеру: одни могут быть направлены к целой хромосоме, другие – к конкретному локусу.

В ходе процесса гибридизации при наличии в исследуемом образце аберрантных хромосом происходит их связывание с ДНК-пробой, которое при исследовании с помощью флуоресцентного микроскопа определяется как флуоресцентный сигнал (положительный результат FISH-теста). При отсутствии аберрантных хромосом несвязанные ДНК-пробы в ходе реакции «отмываются», что при исследовании с помощью флуоресцентного микроскопа определяется как отсутствие флуоресцентного сигнала (отрицательный результат FISH-теста). Метод позволяет оценить не только наличие флуоресцентного сигнала, но и его интенсивность и локализацию. Таким образом, FISH-тест – это не только качественный, но и количественный метод.

FISH-тест обладает рядом преимуществ по сравнению с другими методами цитогенетики. В первую очередь, исследование FISH может быть применено как к метафазным, так и к интерфазным ядрам, то есть к неделящимся клеткам. Это основное преимущество FISH по сравнению с классическими способами кариотипирования (например, окрашиванием хромосом по Романовскому-Гимзе), которые применяются только к метафазным ядрам. Благодаря этому исследование FISH является более точным методом для определения хромосомных аномалий в тканях с низкой пролиферативной активностью, в том числе в солидных опухолях.


Так как в FISH-тесте используется стабильная ДНК интерфазных ядер, для исследования могут быть использованы самые различные биоматериалы – аспираты тонкоугольной аспирационной биопсии, мазки, аспираты костного мозга, биоптаты и, что немаловажно, сохраненные фрагменты ткани, например гистологические блоки. Так, например, FISH-тест может быть с успехом выполнен на повторных препаратах, полученных из гистологического блока биоптата молочной железы при подтверждении диагноза «аденокарцинома молочной железы» и необходимости определения HER2/neu-статуса опухоли. Следует особо подчеркнуть, что в данный момент исследование FISH рекомендовано в качестве подтверждающего теста при получении неопределенного результата иммуногистохимического исследования опухоли на онкомаркер HER2/neu(ИГХ 2+).

Другим преимуществом FISH является его способность определять микроделеции, которые не выявляются с помощью классического кариотипирования или ПЦР. Это имеет особое значение при подозрении на синдром Ди Джорджи и велокардиофациальный синдром.


FISH-тест широко используется в дифференциальной диагностике злокачественных заболеваний, в первую очередь в онкогематологии. Хромосомные аномалии в сочетании с клинической картиной и данными иммуногистохимического исследования являются основой классификации, определения тактики лечения и прогноза лимфо- и миелопролиферативнх заболеваний. Классическими примерами являются хронический миелолейкоз – t (9;22), острый промиелоцитарный лейкоз – t (15;17), хронический лимфолейкоз – трисомия 12 и другие. Что касается солидных опухолей, наиболее часто FISH-исследование применяется при диагностике рака молочной железы, мочевого пузыря, толстой кишки, нейробластомы, ретинобластомы и других.

Исследование FISH также может быть использовано в пренатальной и преимплантационной диагностике.

FISH-тест часто проводят в сочетании с другими методами молекулярной и цитогенетической диагностики. Результат этого исследования оценивают в комплексе с результатами дополнительных лабораторных и инструментальных данных.

Для чего используется исследование?

  • Для дифференциальной диагностики злокачественных заболеваний (крови и солидных органов).

Когда назначается исследование?

  • При подозрении на наличие злокачественного заболевания крови или солидных опухолей, тактика лечения и прогноз которых зависит от хромосомного состава опухолевого клона.

Что означают результаты?

Положительный результат:

  • Наличие в исследуемом образце аберрантных хромосом.

Отрицательный результат:

  • Отсутствие в исследуемом образце аберрантных хромосом.

Что может влиять на результат?

  • Количество аберрантных хромосом.

Также рекомендуется

  • [12-027] Иммуногистохимическое исследование клинического материала (с использованием 1 антитела)
  • [12-028] Иммуногистохимическое исследование клинического материала (с использованием 4 и более антител) 
  • [12-053] Определение HER2 статуса опухоли методом FISH
  • [12-054] Определение HER2 статуса опухоли методом СISH

Кто назначает исследование?

Онколог, педиатр, акушер-гинеколог, врач-генетик.

Литература

  • Wan TS, Ma ES. Molecular cytogenetics: an indispensable tool for cancer diagnosis. Anticancer Res. 2005 Jul-Aug;25(4):2979-83.
  • Kolialexi A, Tsangaris GT, Kitsiou S, Kanavakis E, Mavrou A. Impact of cytogenetic and molecular cytogenetic studies on hematologic malignancies. Chang Gung Med J. 2012 Mar-Apr;35(2):96-110.
  • Mühlmann M. Molecular cytogenetics in metaphase and interphase cells for cancer and genetic research, diagnosis and prognosis. Application in tissue sections and cell suspensions. Genet Mol Res. 2002 Jun 30;1(2):117-27.

Источник: helix.ru

1. Медицинская генетика

Методы анализа кариотипа человека
• стандартные цитогенетические,
• молекулярно-цитогенетические,
• молекулярные методы.

2. Показания для проведения цитогенетической диагностики (Наследственные болезни: национальное руководство)

1
Нарушения репродуктивной функции неясной
этиологии у мужчин и женщин:
1.1
спонтанные аборты (два и более) на разных сроках
беременности, мертворождения или рано умершие дети;
1.2 первичная аменорея;
1.3
Мужское и женское бесплодие при исключении
гинекологических заболеваний у женщин;
2
Множественные врожденные пороки развития у
ребенка
3
Задержка умственного и физического развития у
ребенка
4
Подозрение на хромосомную болезнь на основании
клинических симптомов

3. Показания для проведения цитогенетической диагностики (Наследственные болезни: национальное руководство)

5
Пренатальная и предимплантационная диагностика
при повышенном генетическом риске
6
Подозрение на синдромы, характеризующиеся
хромосомной нестабильностью (учет хромосомных
аберраций и сестринских хроматидных обменов)
7
Гемобластозы и онкологические заболевания
8
Оценка мутагенных воздействий

4.

Цитогенетическа.


ая
Конститутивный
Предимплантационная
кариотип
Пренатальная
Постнатальная
Онкоцитогенетика – анализ кариотипа отдельных соматических клеток

5. Методы анализа кариотипа

• Цитологическое исследование полового хроматина в
ядрах клеток буккального эпителия (экспресс-анализ
аномалий половых хромосом)
• Стандартное цитогенетическое исследование – анализ
метафазных хромосом с помощью методов
дифференциального окрашивания («золотой стандарт»)
• Молекулярно-цитогенетическое исследование (FISH –
флуоресцентная in situ гибридизация специфических ДНКпроб с ДНК метафазных или интерфазных хромосом)
• Молекулярные методы исследования (array-CGH –
сравнительная геномная гибридизация на микроматрицах;
QF-PCR – количественный анализ полиморфных локусов
хромосом, NGS – анализ количественных нарушений
методами секвенирования )

6. Краткая историческая справка

Murray L Barr, Ewart G (Mike) Bertram,
1949 г. – описание полового хроматина в
интерфазных ядрах клеток.
Mary Lyon, 1961 – выдвинута гипотеза
случайной инактивации X хромосомы

7. Цитологическое исследование полового хроматина


Экспресс-диагностика аномалий
в системе половых хромосом. Как
правило выполняется на ядрах
клеток буккального эпителия.
Нативное окрашивание
ацеторсеином
Иммунофлуоресцентное
окрашивание гистона
macroH2A, связанного с
неактивной Ххромосомой

8.

Кариотипирование – диагностическое исследование
хромосом пациента, которое включает в себя определение
числа хромосом (исключение геномных мутаций) и
анализ структуры хромосом (исключение хромосомных
мутаций)
Стадия клеточного цикла
Методы получения
препаратов хромосом
Прямые: используются
клетки, делящиеся in vivo
•клетки костного мозга,
• клетки цитотрофобласта
Непрямые: используются
клетки,
делящиеся in vitro
•лимфоциты периферической крови
•фибробласты кожи
•амниоциты

9. Краткая историческая справка

TC Hsu, 1952 – внедрение гипотонической обработки клеток
при приготовлении препаратов хромосом, начало «новой
эры» в истории цитогенетики.
Peter Nowell, 1960 – использование
фитогеммаглютинина в качестве митогена
при культивировании лимфоцитов.
Torbjörn Caspersson, 1969-1971 гг. – разработка метода
дифференциального окрашивания хромосом.

10. Стандартное кариотипирование


Культивирование лимфоцитов периферической крови
Требования к
биологическому материалу:
1. Использование
антикоагулянта
(гепарина)
2. Стерильность
Культура лимфоцитов:
•Кратковременная (72 ч)
•Митоген (ФГА)
•Цитостатик (колхицин)
•Гипотоническая
обработка клеток
•Фиксация клеток
•Приготовление
препаратов

11. Стандартное кариотипирование

1. Получение препаратов метафазных
хромосом
2. Дифференциальное окрашивание хромосом
3. Микроскопический анализ числа и
структуры хромосом
4. Цитогенетическое заключение

12. Методы дифференциального окрашивания хромосом

G-окрашивание красителем Гимза после обработки протеолитическим
ферментом трипсином (GTG)

13. Методы дифференциального окрашивания хромосом

Q-окрашивание флуорохромом Hoechst 33258 с
контрастированием Actinomycin D (QFH/AcD)

14. Методы дифференциального окрашивания хромосом

R-окрашивание красителем акридиновый оранжевый с использованием
бромдезоксиуридина во второй половине S-периода (RBA). Идентификация
инактивированной X хромосомы

15.

Цитогенетическое исследование
абортного материала при
диагнозе замершая
беременность раннего срока
Результат
кариотипирования:
46,XX,+13,der(13;14)(q10;q10)
Заключение:
В клетках цитотрофобласта
ворсинчатого хориона выявлена
транслокационная форма
трисомии по аутосоме 13
(синдром Патау)
Рекомендации:
1. Кариотипирование
супружеской пары
2. Консультация врача-генетика

16. С помощью методов стандартного кариотипирования


можно:
• идентифицировать все
числовые аномалии целых
хромосом
• выявить структурные
перестройки хромосом на
уровне разрешения 300-850
блоков на гаплоидный набор
• выявить хромосомный
мозаицизм при
определенном количестве
анализируемых клеток
нельзя:
• выявить нарушения в
кариотипе неделящихся
клеток
• в большинстве случаев
достоверно установить
микроделецию или
микродупликацию
• установить природу
добавочного материала и
маркерных хромосом

17. Маркерная хромосома

ПД: плацентобиопсия на
сроке 15/16 недель
Показания — возраст,
БХМ I триместра (1,0/3,86),
риск 1:133
Кариотип в клетках
цитотрофобласта –
47,XX,+mar[21]/46,XX[8]
Рекомендации:
1. Молекулярно-цитогенетическая диагностика (FISH)
для установления природы маркерной хромосомы
2. Кордоцентез

18. Молекулярно-цитогенетическая диагностика

Fluorescent in situ hybridisation (FISH)
Подготовка цитологического препарата
Выбор и подготовка ДНК-пробы
Обработка препарата перед гибридизацией
Проведение гибридизации in situ
Постгибридизационная обработка препарата
Анализ результатов
Заключение по результатам исследования

19. Развитие методов молекулярной цитогенетики на основе технологии FISH


• Методы общего анализа
кариотипа (многоцветная
FISH, SKY, RxFISH, CGH)
• Методы селективного
хромосомного анализа (анализ
численных и структурных
аномалий конкретных
хромосом)
• Методы общего анализа
индивидуальных хромосом
(multi color banding,
«обратная» FISH )
Н.Б.Рубцов, Т.В. Карамышева, Т.А.Гайнер. Современные методы молекулярно-цитогенетического анализа и
диагностика хромосомных патологий.//Геномика-медицине.2005

20. ДНК-зонды

CEP (Chromosome Enumeration Probe)
α- сателлитная ДНК (центромеры)
III сателлитная ДНК (1, 9, 16, 15, Y)
CEP9 CEP15 LSI5p15.2
LSI (Locus Specific Identificator)
микроделеционные пробы
онкологические пробы
CEPX CEPY CEP18
WCP (Whole Chromosome Paints)
TEL (Telomere probe)

21.

Синдром Паллистера-Киллиана: дополнительная изохромосома по
короткому плечу хромосомы 12
12
CEP12
12
CEP12
i(12)(p10)
p
разрыв
p
p
q
i(12)(p10)
Хромосома 12
Лимфоцит крови – 46,XX

22. С помощью метода FISH

можно
исследовать хромосомы неделящихся
клеток
выявить анеуплоидию по
интерфазным ядрам
выявить и уточнить выявленный
хромосомный мозаицизм
уточнить точки разрывов при
структурных перестройках
хромосом
установить природу добавочного
хромосомного материала и
маркерных хромосом
выявить микроперестройки
хромосом (при предполагаемом
диагнозе)
нельзя
• провести полное
исследование всех
хромосом набора
(анализируется
конкретный локус
конкретной
хромосомы)

23. Молекулярно-биологические методы: QF-PCR (КФ-ПЦР количественная флуоресцентная полимеразная цепная реакция)

КФ-ПЦР позволяет проводить
молекулярный анализ анеуплоидий на
некультивируемых эмбриональных
клетках.
Принцип КФ-ПЦР основан на анализе
высокополиморфных коротких
тандемных повторов — STR-маркеров
(гипервариабельных
последовательностей в геноме длиной
2-7 пар оснований), определенных для
каждой хромосомы.
Число аллелей может быть
определено с использованием
флуоресцентно меченых хромосомспецифичных праймеров для каждого
из STR маркеров.

25.

disomic
1
:
1
ATTT
ratio
25
4
trisomic
6
2
:
repeat units
1
4
6
trisomic
1
4
uninformative
:
1
5
:
1
6

26.

Принцип метода КФ — ПЦР
Материнская хромосома
ПЦР
Отцовская хромосома
индивидуумы
Гель
электрофорез
КФ — ПЦР
Аллель 1
Аллель 2
Аллель 3
индивидуумы
Норма
Гетерозигота 1:1
Гомозигота ( неинформативна)
Гетерозигота 1:1:1
трисомия
Гетерозигота 1:2
Гомозигота ( неинформативна)

27.

КФ-ПЦР детекция STR маркеров на хромосомах 13,
18, 21 у плода с трисомией 21 (синдромом Дауна)
D21S11
D21S1437
D18S391
D13S742
D18S380
D21S1411
D13S634
D18S386
D18S535
D21S226
D13S628

28. Использование методов FISH и QF-PCR в целях пренатальной диагностики

преимущества
• возможность анализа
некультивированных клеток
• скорость и производительность
недостатки (объективные)
• Селективный анализа
индивидуальных хромосом. На
по результатам QF-PCR – 47,XXX
основании определения числа копий
отдельных участков нескольких
хромосом заключение о кариотипе
(числе и структуре всего хромосомного
набора) некорректно.
• Остаются проблемы анализа
малопроцентного мозаицизма.
При кариотипировании лимфоцитов 45,X/46,X,i(X)(q10)/47,X,i(X)(q10),i(X)(q10)
• Не решается проблема структурных
перестроек хромосом.

29. Сравнительная геномная гибридизация на микроматрицах (array-CGH)

Метод выявления несбалансированных структурных
перестроек хромосом и анеуплоидий по целым хромосомам.
Разрешающая способность метода позволяет
идентифицировать микроделеции и микродупликации,
невидимые при стандартном кариотипировании
Показания:
•Идиопатическая задержка
умственного и физического
развития у ребенка
•МВПР у плода

30.

Сравнительная геномная гибридизация принцип метода
выделение ДНК из клеток пациента
перекрестное мечение контрольной ДНК и
ДНК пациента (Cy3 и Cy5)
гибридизация на матрице
смеси из равных
ВВ
количеств меченных сравниваемых образцов
Сканирование результатов гибридизации
Обработка полученных данных

31. Сравнительная геномная гибридизация

Результаты
сравнительной
геномной
гибридизации
ДНК клеток
бластоцисты
(зеленое
мечение) с
референсной
ДНК 46,XY
(красное
мечение).
Результат
верифицирован
методом FISH
Fragouli E et al. Hum. Reprod. 2011;26:480-490
© The Author 2010. Published by Oxford University Press on behalf of the European Society of
Human Reproduction and Embryology. All rights reserved. For Permissions, please email:
[email protected]

33. С помощью сравнительной геномной гибридизации

Можно:
•исследовать аномалии кариотипа без цитологических
препаратов, использовать клетки разных тканей
•в отличие от FISH и QF-PCR в одном эксперименте
провести анализ числа всех хромосом и выявить
несбалансированные микроперестройки по всему геному
(в зависимости от плотности покрытия хромосом на
матрице)
Нельзя:
•выявить сбалансированные структурные перестройки!
•выявить низкоклональный мозаицизм (менее 10%)

34.

Высокопроизводительное
секвенирование
Dagan Wells, 48th Annual Postgraduate
Program, ASRM, 2015

35.

Dagan Wells, 48th Annual Postgraduate Program, ASRM,
2015

36. Методы анализа кариотипа

Стандартное кариотипирование на метафазных
хромосомах с помощью методов дифференциального
окрашивания (геномные мутации, хромосомные мутации,
выявляемые на уровне 300-850 блоков).
Молекулярно-цитогенетические методы (FISH) –
уточняющая диагностика структурных перестроек
хромосом, анализ мозаицизма, выявление аномалий
числа отдельных локусов хромосом и структурных
перестроек хромосом в интерфазных ядрах клеток.
Молекулярно-генетические методы (QF-PCR, arrayCGH) – диагностика анеуплоидий по целым хромосомам
и несбалансированных структурных перестроек хромосом
без использования цитологических препаратов.

Источник: ppt-online.org

Определение HER-2 статуса опухоли методом FISH — исследование предрасположенности к развитию опухоли и подбор своевременного адекватного лечения при раке молочной железы (РМЖ) или раке желудка (РЖ).

HER-2 (HER-2/neu) — human epidermal growth factor receptor-2 — это белок, который может влиять на рост раковых клеток. Он создается специальным геном, который называется ген HER-2/neu. HER-2 является рецептором для определённого фактора роста, который называется человеческим эпидермальным фактором роста, естественным образом существующим у человека. Когда человеческий эпидермальный фактор роста прикрепляется к рецепторам HER-2 на раковых клетках груди, он может стимулировать рост и деление этих клеток. В здоровой ткани HER-2 передаёт сигналы, регулирующие пролиферацию и выживаемость клеток, но гиперэкспрессия HER-2 может обусловить злокачественную трансформацию клеток.

Гиперэкспрессия HER-2 при некоторых подтипах РМЖ ведёт к усилению пролиферации и ангиогенеза, нарушению регуляции апоптоза (генетически запрограммированного самоуничтожения клеток). Показано, что при раке молочной железы гиперэкспрессия этого рецептора в ткани опухоли ассоциирована с более агрессивным течением болезни, повышенным метастатическим потенциалом опухоли и менее благоприятным прогнозом. Открытие связи гиперэкспрессии HER-2 с неблагоприятным прогнозом РМЖ привело к поиску таких подходов к лечению, которые направлены на специфическое блокирование онкогена HER-2/neu (таргетная анти-HER2-терапия).

Рак молочной железы (РМЖ) — злокачественная опухоль железистой ткани молочной железы. РЖМ занимает первое место среди всех злокачественных заболеваний у женщин.

В зависимости от наличия биологических маркёров опухоли — экспрессии гормональных рецепторов (эстрогена и/или прогестерона), экспрессии HER-2 — выделяют гормон-рецептор-положительный, HER-2-положительный и тройной негативный РМЖ.

HER-2/neu-положительные (HER-2+) типы рака молочной железы отличаются высокой экспрессией белка HER-2/neu.
HER=2/neu-негативные (HER-2-) типы рака молочной железы отличаются низкой экспрессией или отсутствием белка HER-2/neu.
Считается, что у одной из пяти женщин с раком груди опухоль является HER-2-положительной. Большинство раковых опухолей молочной железы являются гормонально-зависимыми: эстрогены и прогестерон оказывают на них стимулирующий эффект (пролиферативный и неопластический). При HER-2-положительном раке молочной железы на поверхности опухолевых клеток присутствует избыток HER-2-рецепторов. Данное явление носит название «положительный HER-2-статус» и диагностируется у 15–20% женщин, страдающих РМЖ.

HER-2 — рецептор эпидермального фактора роста человека 2-го типа, который присутствует в тканях и в норме, участвуя в регуляции деления и дифференцировки клеток. Его избыток на поверхности опухолевых клеток (гиперэкспрессия) предопределяет быстрый неконтролируемый рост новообразования, высокий риск метастазирования, низкую эффективность некоторых видов лечения. HER-2-положительный РМЖ является особенно агрессивной формой данного заболевания, поэтому точное определение HER-2-статуса имеет ключевое значение для выбора тактики лечения.

Рак желудка (РЖ) — злокачественная опухоль, происходящая из эпителия слизистой оболочки желудка.

РЖ занимает 4-е место в структуре онкологической заболеваемости и 2-е место в структуре онкологической смертности в мире. Заболеваемость РЖ у мужчин в 2 раза выше, чем у женщин. Россия относится к регионам с высоким уровнем заболеваемости РЖ и смертности от данного заболевания. Диагностика РЖ на ранних стадиях затруднена из-за длительного бессимптомного течения заболевания. Часто РЖ выявляют на поздних стадиях, когда 5-летняя выживаемость не превышает 5–10%, а единственным методом лечения остаётся химиотерапия.

Основным методом лечения РЖ является хирургический. Однако у большинства пациентов на момент постановки диагноза определяется распространённый опухолевый процесс, что делает невозможным выполнение радикальной операции и требует проведения системной лекарственной терапии. Проведение химиотерапии статистически достоверно увеличивает общую выживаемость больных метастатическим РЖ, улучшая качество их жизни.

Онкоген HER-2 (erbB-2) был первоначально идентифицирован в опухолях молочной железы. Амплификация и гиперэкспрессия данного гена является относительно специфическим событием для карцином молочной железы и практически не встречается в опухолях других локализаций. Рак желудка представляется одним из немногих исключений: активация HER-2 отмечается примерно в 10–15% злокачественных новообразований этого органа и коррелирует с агрессивным течением заболевания.

Гиперэкспрессия HER-2 является фактором неблагоприятного прогноза. По данным разных исследований, амплификация гена HER-2 у больных РЖ коррелирует с низкими показателями общей выживаемости.

Для оценки HER-2-статуса при РЖ и РМЖ используют FISH метод.

FISH — исследования позволяет определять качественные и количественные изменения хромосом для диагностики злокачественных заболеваний крови и солидных опухолей.

Сегодня во всём мире широко применяются исследования методом FISH.

Метод FISH (флуоресцентная гибридизация in situ) — изучение числа HER-2/neu-генов внутри раковых клеток.

Показания:

  • рак молочной железы — в целях прогноза и подбора терапии; 
  • рак желудка — в целях прогноза и подбора терапии.

Подготовка
Определяется лечащим врачом.

Необходимы гистологический протокол и иммуногистохимический протокол, стекло ИГХ.

Интерпретация результатов
Результаты FISH-теста выражаются следующим образом:

1. Положительный (повышенное содержание, есть амплификация гена HER-2):

  • HER-2-положительный рак молочной железы;

2. Негативный (нет амплификации гена HER-2):

  • HER-2-отрицательный рак молочной железы.

Источник: dnkom.ru


Categories: Другое

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

Этот сайт использует Akismet для борьбы со спамом. Узнайте как обрабатываются ваши данные комментариев.